OPCIÓN OVERLAP PARA HISTOGRAMAS

Hacer histogramas superpuestos  (overlap consiste en comparar resultados, son especialmente importantes para cualquier muestra que solo tiene un color de la fluorescencia, pero tambien puede ser util para dos muestras de muestra de color (un color por vez).



Para hacer histogramas superpuestos (overlap), primero necesitaremos entrar al Menú de File.... Preference (F7), nos aparecerá la siguiente pantalla: 

Debemos asegurarnos de que las opciones Kinetics Mode (simple entire file) y Overlay Time vs Y means estén habilitados, una vez asi, damos click en OK.

Una vez hecho este paso:

1.- Abrimos un histograma normal, en este ejemplo será de FL1,  en seguida abrimos la ventana de Format Histogram.

2.-Deshabilitamos la opción Solid Fill, la opción Smooth la cambiamos del 0 al 10 y seleccionamos el Grosor Medio de la Linea

El resultado es el siguiente:

3.- Entramos nuevamente a Format Histogram, y ahora seleccionamos la opción New File.

4.- Seleccionamos ya sea el mismo archivo que el primer Histograma, si lo que queremos es comparar 2 parametros de la misma muestra  o un nuevo archivo si queremos comparar el mismo parámetro de 2 muestras distintas.

5.- Aparece la siguiente pantalla, en la que seleccionamos el parámetro nuevo que se mostrara en el histograma.(En este ejemplo, compararemos el histograma Fl1 y FL2 de la misma muestra), ahora le damos click en Overlay.

El resultado es el siguiente

6.- Si queremos darle formato al histograma superpuesto, damos click derecho y seleccionamos Format, aparecerá siguiente ventana:

Podemos seguir agregando parámetros con la Opción New File,  o eliminarlos con el botón Delete igualmente cambiar el grosor y color de la línea de cada uno de los parámetros.

7.- Otra opción es este tipo de histogramas es  la de Legend, con esta aparecerán las acotaciones de cada uno de los parámetros en nuestro histograma, para crearlos, basta con dar click derecho y seleccionar la opción Legend:

Formato de Histogramas

Para darle formato a nuestro histograma, damos un click derecho y seleccionamos la opción “Format”

Nos aparece la siguiente pantalla:

Aquí podemos cambiar la escala de eje Y (amarillo), y cambiar  el color en el eje X (rojo), el grosor de la línea:

Otras opcionescomunes son: la escala del eje X, Solid Fill( relleno solido) Show Text y la Vista en 3D (3D View)

Histogramas

1.1.- Al iniciar WinMDI 2.9, seleccione la opción Histogram y damos click en OK.

1.2.- Tambien podemos  abrir un histograma al seleccionar el Menu Display y la opción Histogram  o  tecleando Ctrl +h 

2.- Nos aparecerá la siguiente ventana para buscar la carpeta que contiene el archivo que deseamos abrir:

Una vez que encontramos la carpeta, seleccionamos el archivo que deseamos abrir, éste deberá ser con la extensión .LMD, y damos click en OK.

3.- En seguida aparece la siguiente ventana, donde seleccionamos el parámetro que queremos medir en el Histograma, que pueden ser:  

 

      ·         FS: Forward Scatter .-El tamaño celular relativo

·         SS: Side Scatter.- La complejidad interna o granularidad relativa

·         Fl1, Fl2, … Intensidades relativas de emisión de fluorescencia

·         Todos los parámetros

4.- Damos click en READ.

5.- Aparece nuestro histograma

Abrir WinMDI

2.1 Dar click en el botón de Inicio

2.2 Buscar la carpeta WinMDI

2.3 Damos click en la opción WinMDI 2.9

O desde el escritorio

Al iniciar WinMDI 2.9,  aparecerá la siguiente pantalla. Damos un click

A continuación aparece esta ventana con las opciones de: Histograma, Dot Plot, Density Plot y Contour, veremos cada una por separado

Instalación de WinMDI 2.9

1.1.-  Para iniciar la instalación, inserte el disco WinMDI 2.9 o entre a la pagina: http://en.bio-soft.net/other/WinMDI.html desde donde podrá descargar el instalador. Seleccionar la opción Ejecutar, para instalarlo directamente o Guardar si desea instalarlo mas tarde.

Aparecera la siguiente ventana:

Dele click en Browse… para seleccionar la carpeta donde se guardará el instalador y luego de click en Unzip.

Alternativas (version 2.8):

http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/software/Winmdi.htm

http://facs.scripps.edu/software.html

 1.2.- Abra la carpeta donde guardo el instalador o del desde el CD.

1.3.- Seleccionar la opción SETUP. 

1.4.- Se iniciará el instalador, seguir las indicaciones

1.5.- Para completar la instalación dar click  en “Finish”

Citometria de Flujo

La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de células alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula. Estos parámetros son:
- Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño y la complejidad de su núcleo y citoplasma. El citometro las detecta por medio de las señales de dispersión. La dispersión resulta de la interacción de la luz con una partícula que produce un cambio de dirección en todas las direcciones del espacio y son 2:

- Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula (inmunofenotipo), por medio del uso de fluorocromos.
Un fluorocromo es una molécula química que absorbe luz a una determinada longitud de onda (energía) y emite a una longitud superior (menor energía). Cuando un fluorocromo interacciona con la luz de excitación procedente del láser emite energía radiante. Los citómetros de flujo permiten detectar señales de fluorescencia procedentes de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en una célula, siendo la cantidad de señal de fluorescencia emitida igual a la proporción de la cantidad de componentes fluorescentes de la partícula. Con el uso de fluorocromos se puede detectar hasta 3 colores con un mismo laser. (FL1 verde, FL2 naranja/rojo y FL3 rojo)

De forma esquemática, las células teñidas con anticuerpos monoclonales entran en la cámara de flujo de una en una y, al pasar por delante de un haz de luz de láser, emiten una luz fluorescente y dispersada, que es separada de acuerdo a su longitud de onda por apropiados filtros y espejos. Estas señales luminosas son recogidas por detectores y la información se integra y analiza adecuadamente por un sistema informático.

Formas para mostrar los datos:


HISTOGRAMA.- Muestra uno o más parámetros, como una distribución de frecuencias (256 o 1024 canales) Muestra cuantas células estan marcadas con cierto color/fluoroforo, y las distintas intensidades de fluorescencia de cada una.

Analisis de Datos por histogramas

DOT PLOT.- Muestra correlación de datos de dos parámetros en una resolución de 256x256, y cada punto representa una celula individual. Se dividen en general en los 4 cuadrantes. Tambien podemos mostrar el porcentaje de células de cada uno de los cuadrantes

DENSITY PLOT.- Muestra dos parámetros como la distribución de frecuencias. El color se utiliza para codificar las diferentes frecuencias de los acontecimientos.

CONTOUR PLOT.- Como un gráfico de puntos, un gráfico de contorno muestra los datos de correlación de los dos parámetros, con líneas de contorno que une puntos de igual elevación (distribución de frecuencias).

¿Qué es la Citometría de Flujo?

Este video nos muestra de forma sencilla como funciona

esta herramienta cientifica